曲古抑菌素 A 对外周血自然杀伤细胞 活性和功能的影响

文章编号: 1671- 7554( 2009) 08-   0050-   05

曲古抑菌素 A 对外周血自然杀伤细胞 活性和功能的影响

王向玲1 , 纪春岩1 , Magnus Nordenskjld2 , Jan- Inge Henter3 , 郑成云2, 3, 4

( 1 .   山东大学齐鲁医院血研室,   济南 250012;   2.   瑞典卡罗林斯卡大学医院临床分子医学中心,   斯德哥尔摩 171 76;

3 .   瑞典卡罗林斯卡大学医院小儿癌症研究中心,   斯德哥尔摩 171 76;   4.   山东大学第二医院血液科,   济南 250033)

摘要: 目的   探讨曲古抑菌素A(TSA) 对正常人外周血自然杀伤细胞( NK) 活性和功能的影响。方法   从正常人外 周血单 个核细胞( PBMCs) 分离 淋巴细胞( PBLs) ( 主要 包括T 细胞和 NK 细胞) 或纯化 NK 细胞。体外应用白介 素-2 ( IL- 2) 诱 导PBLs 72 h 产生淋巴因子激活的杀伤( LAK) 细胞。将PBLs , LAK 或 NK 细胞进行体外培养, 给予不同浓度 的TSA 处理 12、24、48 h。流式细胞术检测 NK 细胞和T 细胞的凋亡; 采用51Cr 释放试验检测NK 细胞的杀伤功能。结 果 TSA 以剂量和时间依赖方式诱导PBLs 和 LAK 细胞凋亡, TSA 处理组淋巴细胞及 LAK 细胞凋亡百分率明显高于 对照组( P< 0. 05) ; TSA 同样可诱导静止期NK 细胞的凋亡, 0. 1umo/lL TSA 作用于NK 细胞24 h 后, 36% NK 细胞凋亡, 显著高于未处理组( P < 0 . 05) ; 0. 1 umo/lL TSA 作用于 NK 细胞 12 h 后, 其杀伤白血病细胞的能力明显低于对照组 ( P<   0. 01) 。结论 TSA 能够诱导人外周血静止期NK 细胞及LAK 细胞发生凋亡, 并影响NK 细胞的细胞毒作用。   关键词: 组蛋白去乙酰化酶抑制剂; 自然杀伤细胞 ; 凋亡; 细胞毒作用

中图分类号: R331 . 144; R979 . 1            文献标志码: A

Effects of trichostatin A effects on natural killer cell survival and activity

WANG Xiang- ling1 ,   JI Chun- yan1 ,   Nordenskjld Magnus2 ,   Henter Jan- Inge3 ,   ZHENG Cheng-yun2, 3, 4

( 1 .   Department of Hematology,   Qilu Hospital of Shandong University,   Jinan 250012,   China;

2.   Clinical Genetics Unit ,   Department of Molecular M edicine and Surgery,   Karolinska University Hospital ,   Karolinska Institutet ,

Stockholm 171 76,   Sweden;   3.   Childhood Cancer Research Unit ,   Department of Woman and Child Health ,

Karolinska University Hospital ,   Karolinska Institutet,   Stockholm 171 76,   Sweden;

4.   Department of Hematology,   The Second Hospital of Shandong University,   Jinan 250033,   China)

Abstract:   Objective   To explore the potential regulatory efects of trichostatin A (TSA)   on survival and activity of natural killer ( NK)   cells.   Methods    Human peripheral blood lymphocytes( PBLs) or NK cells were separated or isolated from peripheral blood

mononuclear cells ( PBMCs)   of healthy blood donors.   Lymphokine activated killer ( LAK)   cells were generated by culturing PBLs in the presence of interleukin- 2 for 72 h.   The cells were cultured in the presence or absence of TSA at the concentrations( 0 . 01, 0. 1 and/or 1umo/lL) for 12 h,   24 h and/or 48 h,   respectively . Apoptotic cells in PBLs,   LAK or purified NK cells were cytomet- rically   quantified by dual labeling of propidium iodide ( PI)   and Annexin- V ( AV) .   The proportion of apoptotic cells in PBLs were

further defined by combined staining of AV,   ant-i CD56 and ant-i CD3 antibodies,   and flow cytometry method ( FCM ) .   NK   cell cytolytic activity against   leukemia   cells ( K562 leukemic cell line)   was evaluated using a standard chromium- 51 release   assay.

Results    TSA markedly induced apoptosis in PBLs and LAK cells in a dose- and time- dependent manner. T he percentages of to-     tal apoptotic cells   ( AV +   P   plus AV +   PI +   )   in the TSA treated- PBLs or- LAK   cells were   significantly   higher than that in         the untreated ones( P < 0. 05) .   Moreover,   the percentage of total apoptotic cells in the purified resting NK cells treated by TSA

收稿日期: 2008- 1 11

基金项目: 国家自然科学基金资助项目( No . 30670903) , 瑞典研究委员会及瑞典癌症基金会资助项目。

作者简介: 王向玲( 1971-   ) , 女, 博士, 主要从事恶性血液病的基础与临床研究。

通讯作者: 郑成云( 1962-   ) , 男, 博士, 主要从事恶性血液病的基础与临床研究。E- mail:   chengyun. zheng@ ki. se

( 0. 1 umo/lL)   for 24 h was significantly higher than that in the control NK cells ( P <   0. 05) .   Importantly,   the cytolytic activity of resting NK cells against leukemia cells significantly decreased after treatment with 0 . 1umol/L TSA for 12 h ,   as compared to the

control NK   cells( P <   0. 01) .   Conclusions    The histone deacetylase inhibitor TSA can   induce apoptosis in NK   cells and LAK cells,   and can afect NK   cell cytotoxicity.

Key words:   Histone deacetylase inhibitor;   Natural killer cell;   Apoptosis;   Cytotoxicity

组蛋白去乙酰化酶抑制剂( histone   deacetylase inhibitor, HDACIs) 具有抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿 瘤细胞分化和凋亡作用[ 1]   , 并通过抑制肿瘤血管生 成、增加肿瘤细胞免疫原性来影响其生长[2- 3]   。 曲古 抑菌素 A ( trichostatin A, TSA ) 是一种 HDACIs, 既往 研究表明, TSA 对肝癌、胃癌、口腔癌及神经母细胞 瘤等肿瘤细胞均具有明显细胞毒作用[ 4]   。

自然杀伤细胞( natural killer cell,   NK 细胞)   是 参与先天免疫反应的大颗粒淋巴细胞, 在机体抗病 毒、抗肿瘤免疫应答方面发挥重要作用。NK 细胞表 达的活化性受体和抑制性受体分别传递正性和负性 信号, 调控 NK 细胞的功能[ 5]   。

*近的研究显示, HDACIs 可上调肿瘤细胞表面 NK 激活性受体配体的表达, 从而增加NK 细胞对靶 细胞的杀伤敏感性[ 6]   。然而, HDACIs 对免疫细胞本 身尤其是对 NK 细胞的毒性作用的研究报道甚少。 本研究旨在观察 TSA 对外周血淋巴细胞尤其是对 NK 细胞存活和杀伤功能的影响。

1    材料与方法

1. 1    细胞   K562 细胞培养于含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养液中, 淋巴细胞来自瑞典卡罗林斯卡 医院健康献血员肝素抗凝的外周静脉血。

1. 2    试剂、抗体及主要仪器 TSA 购自 Sigma 公司, 重组人 IL- 2 购自美国 R&D 公司, 磷脂结合蛋白 V- 异硫氢酸荧光素( AnnexinV- FITC) 、碘化吡啶( PI) 购 自德国罗氏公司, FicolPaque 分离液、铬 51( 51Cr) 购 自瑞典Amersham Biosciences 公司, PE 标记的CD3 抗 体、PE- CY5 标记的 CD56 单抗购于美国 Pharmingen 公司, NK 细胞阴性选择试剂盒购 自德国美天旎公 司。y 计数仪为瑞典Wallac 公司产品, 流式细胞仪 FACS Calibure 为美国 Becton Dickinson 公司产品。

1. 3    淋巴细胞、NK 细胞的分离和培养   人肝素抗 凝外周血 20 mL 加人等体积磷酸盐缓冲液( PBS) 稀 释后,   缓慢加于 FicolPaque 分离液上, 1 200 g/min 离心 30 min, 移液器吸取单个核细胞层, PBS 洗涤 2 次, 用含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养液调整细

培养箱中孵育50 min, 以去除贴壁的单核细胞, 收集 未贴壁的PBLs; 采用NK 细胞阴性筛选试剂盒纯化 NK 细胞( CD56+   CD3-   ) , 参照说明书进行操作。所 获取的NK 细胞( CD56+   CD3-   ) 纯度均高于 90% ( 图 1) 。调整 PBLs 浓度至 1 x 106/mL , 加入 IL- 2 400 U/ mL 培养 72 h 后获得 LAK 细胞, 其中 CD3+   细胞占 87. 02% , CD56+   CD3-   细胞占 8. 83% ( 图 2) 。

图 1    流式细胞术检测NK 细胞纯度

Fig. 1    The purity of NK cells was assayed by flow cytometry

图 2      LAK 细胞的比率

Fig. 2    The percentage of LAK cells

1. 4    流式细胞术检测细胞凋亡   将 PBLs、NK 细胞 或LAK 细胞( 1 x 106/mL) 接种到 24 孔培养板中, 分 别加入不同浓度的TSA( 0. 01、0. 10、1. 00 umol/L ) , 对 照组加等量的 TSA 溶剂( 培养液稀释的DMSO ) , 分 别培养 12、24、48 h 后, 收集细胞并用冷 PBS 洗涤 2 遍。用含有 AV-FITC 和 PI 的结合缓冲液重悬细胞 并充分混匀, 室温避光孵育 15 min 后, 加入 400 uL 孵育缓冲液, 1 h 内流式细胞仪检测细胞凋亡。采用 AV-FITC 和抗 CD56、CD3 抗体双染方法检测 NK 细 胞凋亡情况,   收集细胞洗涤后, 用含有 CD3-PE、

胞浓度为3 x 106/mL 。将获得的 PBMCs 悬液置37 C CD56- PE- CY5抗体缓冲液进行细胞膜表面标记染

色, 4   C避光孵育 30 min 后, PBS 洗涤 2 遍, 进行 AV- FITC 标记, 方法同上。

1. 5    51 Cr 释放试验测定细胞杀伤活性   不同浓度 TSA 处理 12 h   的 PBLs 为效应细胞( E) , 51 Cr 标记的 K562 为靶细胞( T) 。效应细胞与靶细胞按一定比例 ( E:T ) 混合于 96 孔细胞培养板, 培养 4 h, 收集上清 液。应用 y计数仪测定上清液中放射量( 以 cpm 值 表示) 。特异性杀伤率( % ) =   ( 实验孔释放的 cpm 值- 靶细胞自发释放的 cpm 值) /( 靶细胞**释放 的 cpm 值-   靶细胞自发释放的 cpm 值)   x 100% 。

1. 6    统计学处理   统计学分析采用SPSS 11. 0 统计 学软件进行, 数据以 土 s 表示, 两样本比较采用 t 检验, P< 0. 05 为差异有统计学意义。

2    结   果

2. 1    TSA 对细胞凋亡的影响   见图 3、图 4、图 5。

由图3 可见, 随着TSA 作用时间延长和浓度增加, 凋 亡的 PBL 百分数相应升高。 同对照组相比, 0.   1 umol/L TSA 作用24 h, PBLs 出现明显的细胞凋亡, 高 浓度的TSA( 1 umol/L) 仅作用 12 h 时, PBLs 即出现显 著的细胞凋亡( P< 0. 05) , 当延长到 48 h 时, 50% 以上 的PBLs 凋亡( P< 0. 01) 。TSA   同样以时间和浓度依 赖性方式诱导LAK 细胞凋亡。 由图4 可见, 相比对照 组, 低浓度的TSA( 0. 1 umol/L) 作用 12 h 时, LAK 细胞 的凋亡率明显升高( P<   0. 05) , 随着时间的延长和浓 度的增加, 两组之间差异显著性升高( P< 0. 01) 。为了 明确凋亡的PBLs 中各细胞亚群情况, 以 CD56 和 CD3 作为细胞表面标记限定NK 细胞群( CD56+   CD3-   ) , 联 合AV 染色。结果显示, 0. 1 umol/L TSA 处理 PBLs 24 h 后, NK 细胞凋亡率为 36% , 说明 TSA 可诱导 NK 细胞凋亡。进一步实验发现, 0. 1 umol/L TSA 处理NK 细胞 12 h 后, 即有14%NK 细胞凋亡, 作用24 h 后NK 细胞的凋亡率明显高于对照组( P< 0. 05 ) ( 图 5) 。

图 3    流式细胞术检测不同浓度的 TSA 对PBLs 凋亡的影响

Fig. 3   Apoptotic cells induced by TSA in PBLs were quantified by flow cytometry

图 4    流式细胞术检测不同浓度的 TSA 对 LAK 细胞凋亡的影响

Fig. 4    Apoptotic cells induced by TSA in LAK cells were quantified by flow cytometry with dual staining of PI and Annexin-V

图 5    不同浓度 TSA 对 NK 细胞凋亡的影响 Fig . 5   TSA induces apoptosis of NK cells

2. 2   TSA 对淋巴细胞杀伤功能的影响   为进一步 观察TSA 对 NK 细胞杀伤功能的影响, 利用51 Cr 释

细胞特异性杀伤的靶细胞, PBLs 杀伤能力可反映 NK 细胞的细胞毒活性。结果发现, 经 0. 1 umol/L TSA 作用后的 PBLs , 其特异性杀伤靶细胞的能力显 著低于未处理组( P< 0. 01) ( 图 6) 。

图 6    TSA 对外周血 NK 细胞杀伤功能的影响

放试验评估NK 细胞的杀伤能力。K562细胞是 NK      Fig.6    The efect ofTSA on NK cell cytotoxicity

54                                                       山   东   大   学   学   报   ( 医   学   版)                                                      47 卷 8 期

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( 编辑: 齐眉)