细菌基因组DNA提取

细菌基因组DNA提取

快速微量提取法

1.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Eppendorf管中，13000rpm离心1min, 弃上清液，收集菌体。

2.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠, 1mMEDTA， 1%SDS,pH7.8）混匀,置于37℃水浴1h。

3.然后加入200ul 5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。

4.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

5.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾 (3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ul TE溶液中，置4℃保存备用。

蛋白酶/SDS法制备

1.取10ml菌体（如：Delftia sp）过夜培养物于一灭菌Eppendorf管中，4000rpm离心10min收集菌体。

2.用Washing TE（50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA pH8.0）洗菌体2次。

3.将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h。

4.接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次。

5.氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。

酚氯仿

1.细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。

2.菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/L NaCl50μl，10% SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）

3.抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，**枪头尖应剪去）

4.沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。

5.洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。

6.抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中

通用方法

1.过夜培养细菌。

2.离心后收集菌体，并悬浮在 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA.中。

3.重悬菌体放入-20℃保存。

4.在冰冻的悬浮物重加入0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml溶菌酶，室温解冻菌体，解冻后置冰上45分钟。

5.加入1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml蛋白酶K，50℃水浴60分钟。

6.用6ml Tris-苯酚（1：1）抽提，然后 10000g离心15分钟，将上清转移到新的Ep管中，必要时再重复此步骤。

7.加入1/10体积3M醋酸钠，轻柔混匀。再加入2倍体积95%乙醇，颠倒混匀。

8.将絮状DNA转移到5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase.溶液中，4℃摇动溶解过夜。

9.加入等体积氯仿抽提，颠倒混匀，10000g离心5分钟，将上清转移到新的Ep管中。

10.加入1/10体积3M醋酸钠，轻柔混匀。再加入2倍体积95%乙醇，颠倒混匀。

11.将絮状DNA转移到5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA。

12.Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.

13.电泳和分光光度计检测基因组DNA纯度。

方法五

1.100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。

2.加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS（裂解细胞）, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K（降解蛋白）, 混匀, 37℃保温1小时。

3.加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。

4.加1.5ml CTAB（去除多糖成分）/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。

5.用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。

6.用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。

7.加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。

8.用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。

9.如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。

注：

1.CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。

2.氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。

血液基因组DNA提取

方法1

1.取0．5ml抗凝全血放人一支1．5ml离心管中，加入二倍体积的红细胞裂解液（0．155mol／L NH4Cl，0.01mol/L NaHCO3，0.127mol/L EDTA），混匀。

2.室温下静置20min，以溶解红细胞，10000r/min 离心10min，使血细胞沉淀下来，弃上清。

3.重复上述操作2-3次，以彻底除去血红蛋白。直至在离心管底出现白色的白细胞沉淀。

4.加入DNA抽提液（10mmol/L Tris.Cl（pH8.0），0.1mmol EDTA（pH8.0），1.0 % SDS）0.5ml，悬起沉淀的白细胞。

5.37℃水浴保温1h后，高速振荡10-15s，再沸水浴10min后，10000r/min 离心 10min，使细胞碎片及变性蛋白质沉淀，

6.在上清液中加入2倍体积的95%的冰冻乙醇，静置沉淀20min，12000r/min 离心15min，弃上清，自然晾干，加入30ulTE备用。

改良CTAB法

1.在装有血液的2 ml离心管中加入500 ul预热的4xCTAB提取液和2ul β一巯基乙醇，使材料完全分散在提取液中，65℃温浴约1.5 h．

2.待冷却至室温后加入等体积的氯仿—异戊醇(24：1)，上下颠倒离心管，温和混匀5 min。

3.然后离心5 min (1 000 rad／min)．将上清液转管，反复抽提3次．*后一次离心10 min．

4.吸取上清液，加入70 体积的异丙醇，沉降DNA，轻轻颠倒2-3次，可见白色絮状沉淀，室温下静置30 min以上。

5.然后10 000 rad／min离心7 min，弃上清．用200 uL 70%的乙醇和无水乙醇各洗2次，每次离心2 min后，弃上清。

6.然后将离心管放在37℃ 烘箱中(或室温下)使乙醇挥发．待总DNA 干燥后加50ul TE溶液和1.5ul RNase于37℃水浴中温浴2 h，然后于-20℃(或4℃)冰箱中保存备用．

饱和氯化钠抽提法

1.取0.5ml抗凝全血，加入0.8ml TE(pH 8.0)混匀；

2.室温离心，10000rpm ，1分钟；

3.弃上清，加入0.4ml TE(pH 8.0)，混匀，悬浮细胞；

4.加入10mg/ml蛋白酶K 5μl（终浓度100μg/ml）,10% SDS 25μl(终浓度0.5%)，混匀；

5.37℃水浴消化过夜，或50℃消化4小时；

6.加入1/3体积的饱和氯化钠，充分混匀，4℃静置10分钟；

7.10000rpm离心10分钟，取上清于另一新管中；

8.加入等体积氯仿，混匀，10000rpm离心10分钟；

9.取上清于另一新管中，加入1/20体积的3M NaAc(pH 5.2)混匀；

10.加入2倍体积无水乙醇轻轻混合，10000rpm离心1分钟；

11.弃上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗涤；

12.10000rpm离心1分钟，弃上清，自然干燥DNA约5分钟；

13.加入200-250μl TE，-20℃保存；

14.检测浓度及纯度。

酚氯仿抽提法

1.外周血反复冻溶破坏红细胞，取0.5ml外周血，加入0.5ml PBS混匀后，10000rpm 离心10分钟；

2.弃上清，加入180μl TE(pH 8.0)，20μl 10% SDS, 10mg/ml蛋白酶K 5μl（终浓度100μg/ml）混匀；

3.37℃水浴消化过夜，或50℃消化4小时；

4.加入等体积的饱和酚并充分混匀，10000rpm离心10分钟；

5.吸取上清液于另一新管中，重复上一步骤一次；

6.吸取上清液于另一新管中，加入等体积的酚氯仿并充分混匀，10000rpm离心10分钟；

7.吸取上清液于另一新管中，加入1/20体积的3M NaAc(pH 5.2) 混匀后，加入2倍体积无水乙醇并轻轻混合，可见絮状乳白色DNA团块，10000rpm离心10分钟；

8.弃上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗涤；

9.10000rpm离心1分钟，弃上清，自然凉干后加入TE液，-20℃保存；

10.检测浓度及纯度

动物组织基因组DNA提取

材料

1.生理盐水

2.十二烷基硫酸钠（SDS）

3.三羟甲基氨基甲烷（Tris）

4.乙二胺四乙酸（EDTA）

5.饱和酚

6.氯仿

7.异戊醇

8.无水乙醇

9.75%乙醇

10.蛋白酶K

11.RNase酶

12.手术剪刀、镊子、吸水纸

13.微量取液器

14.研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL离心管架、记号笔

试剂配制

Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml

配制方法： 40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转移到50ml容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

生理盐水: 0.85%NaCL 100ml

配制方法：在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml

配制方法：将9.08g的EDTA•Na2•2H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入）调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA•Na2•2H2O。

TES缓冲液（释放DNA） 100ml

配制方法：将0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

10% SDS（变性剂 破细胞壁）100ml

配制方法：将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68℃加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4℃保存备用。

蛋白酶K（降解蛋白质）：20mg/mL 无菌三蒸水溶解。

RNA酶 （降解RNA）

配制方法：将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris•CL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于–20℃。

氯仿：异戊醇=24：1 100ml

按24:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4℃保存备用。

TE缓冲液（溶解DNA） PH8.0 50ml

配制方法：将0.5ml 的10mmol Tris-HCl(PH8.0) 、0.1ml的0.5mol/l EDTA(PH8.0) 加入到50ml的容量瓶中，调PH8.0定容至50ml摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

实验操作方法

1.

1.组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5g组织，放入1.5ml离心管中，剪碎。

2.加入0.45ml TES混匀，再加入50ul SDS（10%），5.0ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀后，于56°C保温4-6h，每2h摇1次。

3.放置到室温，加入等体积饱和酚（500ul），颠倒混匀，10000r/m，离心10m，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml离心管。

4.加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层转移到新的1.5ml离心管中。

5.加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层清液到一个新的1.5ml离心管。

6.加入2.5倍体积的-20°C预冷的无水乙醇沉淀DNA，观察现象。

7.12000 r/m，离心10分钟，弃乙醇。

8.-20°C保存的75%乙醇洗涤，10000 r/m，离心5分钟，去乙醇，55°C干燥DNA。

9.加入适量TE溶解DNA（具体依DNA的多少而定），-20°C保存备用。

1.

1.取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）

3.加等量的酚-氯仿-异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

5.取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。

植物组织基因组DNA提取

1.2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热；

2.取少量植物组织置于试管中，用小杵磨至粉状；

3.加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀；

4.置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；

5.冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇(24:1) 至满管，振荡2~3 min，使两者混合均匀；

6.10000 rpm离心10 min，与此同时，将600 μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；

7.10000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

8.10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出

9.加入800 μl 75%的乙醇，将DNA洗涤 30 min；

10.10000 rpm离心30s后，立即倒掉液体，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；

11.加入50 μl 0.5 × TE缓冲液，使DNA溶解；

12.置于-20℃保存、备用。

较为常用的细菌DNA提取方法：

实验步骤：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

细菌基因组DNA提取

取出10ml培养好的细菌培养液，5000rpm,10min,用TE洗涤后，再离心，菌体重悬于4mlTE溶液。

1．加入50mg/ml溶菌酶溶液8μl（终浓度为100μg/ml），37℃保温20min。

2．加入RNase（10mg/ml）10μl,至终浓度为25μg/ml，然后加入10％SDS溶液0.5ml，37℃保温30min。

3．加入蛋白酶K（20mg/ml）10μl，至终浓度为50μg/ml），然后加入，37℃保温60～90min。

4．加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，8000rpm×5min,取上清液转入另一离心管中。如此2～3次，即可。

5．将上清液中加入1／5体积的醋酸钠，2倍体积的冷的无水乙醇，旋转离心管，会出现沉淀物DNA。

6．70％乙醇洗涤一次，室温下干燥，但勿使DNA完全干燥，以便使其易溶。

7．加入0.5mlTE或双蒸水溶解DNA，测定值OD260和OD280，确定DNA含量和纯度。

8．－20℃保藏。