微生物菌种的保存方法

　　一、传代保存法：

　　有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是*基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于*适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。

　　一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：

　　①菌种管棉塞经常容易发霉;

　　②菌株的遗传性状容易发生变异;

　　③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;

　　④需要定期转种，工作量大;

　　⑤杂菌的污染机会较多。

　　二、液体石蜡覆盖保存法：

　　该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。

　　三、载体保存法：

　　即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如：

　　①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)，置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤**持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种，培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止，移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封，冷藏或室温保存。

　　②砂土保存法：取清洁的砂，筛去掉大砂粒，并用磁铁吸去砂中铁屑，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次，干燥后，置于试管或安瓶管中保持2～3cm深，再经干热灭菌后，加入1mL菌种培养液，经充分混匀后，放入真空干燥器中，完全干燥后熔封保存。也可用二份洗净的砂(经HCl预处理)和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌，再进行菌种保藏。

　　③硅胶保存法：以6～16目的无色硅胶代替砂子，干热灭菌后，加入菌液。加菌液时，由于硅胶的吸附热常使温度升高，因而需设法加以冷却。

　　④磁珠保存法：将菌液浸入素烧磁珠(或多孔玻璃珠)后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的.硅胶(或无水CaSO4)，上铺玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，经干热灭菌后，接入菌悬液，*后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效，特别适用于根瘤菌，可保存长达两年半时间。

　　⑤麸皮保存法：在麸皮内加入60%的水，经灭菌后接种培养，*后干燥保藏。

　　⑥纸片(滤纸)保存法：将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中，常压或减压干燥后，置于装有干燥剂的容器内进行保存。

　　四、悬液保存法：

　　即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。常用的方法有：

　　①蒸馏水保存法：适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌，将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。

　　②糖液保存法：适用于酵母菌，如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗处保存，可长达10年。除此之外，也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。

　　五、寄主保存法：

　　即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

　　六、冷冻保存法：

　　适用于抗冻力强的微生物。这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下而不受损伤，而对其它大多数微生物而言，无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结，都会对菌体造成损伤，当采用这种保藏方法时，应注意以下几点：

　　① 要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞。

　　② 要选择适宜的培养基，因为某些微生物对冷冻的抵抗力，常随培养基成分的变化而显示出巨大差异。

　　③ 要选择合适的菌液浓度，通常菌液浓度越高，生存率越高，保存期也越长。

　　④ **在菌液内不添加电解质(如食盐等)。

　　⑤ 可在菌液内添加甘油等保护剂，以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样，也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂，但对有些微生物而言，不加保护剂时更有效。

　　⑥ 原则上应尽快进行冷冻处理，但当加入保护剂时，可静置一段时间后再进行处理。

　　⑦ 就动物细胞而言，应在-20℃范围内以1℃/min左右的速度缓慢降温，此后必须尽快降到贮藏温度;而对绝大多数微生物而言，则不必如此，如结构较为复杂的原虫则可在-35℃范围内进行缓慢降温，而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻。

　　⑧ 若进行长期保存，则贮藏温度越低越好。

　　⑨取用冷冻保存的菌种时，应采取速融措施，即在35～40℃温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说，则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后，应尽量避免再次冷冻，否则菌体的存活率将显著下降。

　　常用的冷冻保存法包括：

　　①低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：

　　低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便，也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多，有些可添加保护剂。此外，也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器内，再放入低温冰箱内进行保存的。

　　②干冰保存法(-70℃左右)：

　　即将菌种管插入干冰内，再置于冰箱内进行冷冻保存;

　　③液氮保存法(-196℃)：

　　是适用范围*广的微生物保存法。

　　其操作步骤如下：

　　a、装安瓶管：使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂(保存霉菌不用防冻剂)的灭菌溶液中，将0.2～1mL的这种溶液分装于安瓶中，或在装有分散剂的安瓶中直接接种，或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中。

　　b、熔封安瓶管：若直接贮存于气相液氮中(-150℃～-170℃)时，则不需熔封。

　　c、检查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡2～30分钟后，观察有无色素进入安瓶。

　　d、缓慢冷却：将熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮气以约1℃/min的速度冷却至-25℃左右，也可在-20℃～-25℃的冰箱内缓慢冷却30～60min。

　　e、速冷：*后浸入液氮中快速冷却至-196℃。

　　七、冷冻干燥保存法：

　　其原理是首先将微生物冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分。事实上，从菌体中除去大部分水分后，细胞的生理活动就会停止，因此可以达到长期维持生命状态的目的。该方法适用于绝大多数微生物菌种(包括噬菌体和立克次氏体等)的保存。在进行冷冻干燥时，需注意以下几个问题：

　　a、冷冻干燥前的培养条件：首先检验菌种纯度。一般地说，将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜;菌龄以达到对数生长期为好;若为有芽孢或孢子的微生物，则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好;菌液浓度以高为好，如细菌应达到109～1010/mL。

　　b、菌株号码等的标记：可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签。

　　c、安瓶的准备：将安瓶在2%HCl中浸泡过夜，自来水冲洗3次后，蒸馏水刷净，干燥，塞棉塞，贴标签，干热灭菌或温热灭菌后，60℃恒温干燥。

　　d、添加保护剂：常用的保护剂有脱脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉汤以及加7.5%葡萄糖的血清等。甘油管保藏法：在5mL菌种保藏管中，将等体积的菌悬液和40%的甘油充分混匀后，于-20℃冰箱中保存。

　　八、甘油管保藏法：

　　在5ml菌种保藏管中，将等体积的菌悬液和40%的甘油充分混匀后，于-20℃冰箱中保存。