基因合成技术概述

基因合成技术概述

随着生物行业的不断发展，基因合成技术越来越成熟。一套完整的基因合成流程包括了密码子优化、引物合成、PCR扩增、连接转化、菌检、测序、QC酶切验证。基因合成技术因其合成周期短、不受基因来源限制等优点得到了广泛应用。基因合成是指在体外人工合成双链DNA分子的技术，是基因获取的手段之一，相对于从已有生物中获取基因来说，基因合成无须模板，因而不受基因来源限制。

关键词 密码子优化；引物合成；基因合成；一代测序

1 导言

在基因合成前，为使基因在不同生物表达体系中都能得到良好表达，研究人员通常会对基因进行密码子优化。遗传密码有 64种，但是绝大多数生物傾向于利用这些密码子中的一部分，那些被*频繁利用的称为**密码子（optimal codons），那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子（rare orlow-usage codons）。实际上用做蛋白表达或生产的每种生物（包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，植物细胞和昆虫细胞）都表现出某种程度的密码子偏爱性，因此，重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响（尤其在异源表达系统中）。在不改变其编码蛋白的情况下，对一个蛋白的编码基因进行改变，去除稀有密码子，合理优化其 mRNA二级结构，GC含量等的过程叫密码子优化。密码子优化的原理即根据将要使用的表达系统的密码子偏爱性，针对目标蛋白序列中的每一个氨基酸选择不同的密码子进行全序列的组合，找出其中**的一条。

2 引物合成

研究人员根据自己的意愿确定合成的基因序列后，由于没有模板，首先需根据待合成的双链DNA设计引物、合成引物。引物（primer），又名引子，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。简单地说，引物即是短的单链DNA或短的RNA链，序列长度一般为15～90 nt （nt为引物碱基单位，有些也用nt或bp标识），一般不超过120 nt。目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA偶联在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向依据既定引物序列由3′端向5′端延伸，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接[1]。

3 引物互为模板PCR扩增

引物合成后，引物之间互为模板进行PCR扩增。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍[2]。

4 连接转化、菌检送测

通过PCR反应，可扩增出我们需要的双链DNA。但PCR产物稳定性较低，我们需将连接到质粒上，转化进感受态中，涂平板过夜培养。第二天早上就可以从平板中挑选阳性克隆，挑到的克隆需要再次使用菌落 PCR验证是否有全长的基因插入，使用首尾引物进行PCR，如果有产物，说明有目的基因。将验证过的克隆转化进入试管培养摇菌，之后，抽提质粒，纯化送去进行测序[3]。

5 一代测序

目前，我们采用的是一代测序，也叫sanger测序。Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处終止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

6 QC验证

将测序结果与目标基因进行比对，同时进行QC酶切验证，如果测序结果与酶切验证结果均正确，就完成目的基因的合成了。按照上述步骤，顺利的情况下5天时间就能合成出一段800bp左右的基因序列。

目前，基因合成周期短，同时可以保证序列的100%正确无误，具有很大的灵活性，可以对基因的酶切位点和基因序列进行修改，方便下游的克隆和实验；研究人员根据自己的意愿设计得到自然界中很难获得甚至不存在的基因；基因合成的基因可以进行密码子优化，使基因在各种生物表达体系中都能得到良好表达。这些优点使得基因合成在生物领域有着广泛应用，比如克隆人鼠抗体或重组抗体、合成不同的基因突变株、SNPS或其他突变株、设计合成DNA疫苗、大量合成用于微芯片的cDNA等。基因合成技术的发展使生物领域又上了一个新台阶。

参考文献

[1] 冯淼，王璐，田敬东.基因合成技术研究进展[J].生物工程学报，2013，29（8）：1075-1085.

[2] 王霞，赵鹃，李炳志，等.DNA合成技术及应用[J].生命科学，2013，25（10）：993-999.

[3] 赵晓娟，刘金毅，蔡有余，等.发展中的DNA测序技术[J].中国生物工程杂志，1997，17（4）：51-54.