凝胶电泳技术

凝胶电泳技术

在电场的作用下，不同的带电荷分子或颗粒，通过凝胶介质的迁移速度存在差异。凝胶电泳便是根据这一物理现象发展出来的一种分离、鉴定及纯化核酸及蛋白质大分子的生化实验技术。主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两大类。

凝胶电泳在分子生物学及基因工程研究中具有重要的用途，已经发展成为分析鉴定重组DNA分子、研究蛋白质与核酸相互作用的重要的实验手段。同时也是现在通用的许多分子生物学研究方法，例如质粒DNA分子及限制片段的分离、鉴定与纯化以及DNA分型、核苷酸序列测定和DNA限制图构建等的技术基础。

一   基本原理

凝胶电泳的原理比较简单。我们知道当一种分子被放置在电场中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快，反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和丙稀酰胺凝胶等，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩尔系数成反比的。已知摩尔系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分，按大小分部彼此分离开来。

在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。从这种意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子（polyanions）。因此，当核酸分子被放置在电场当中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。

二   凝胶的主要类型

1. 聚丙稀酰胺凝胶（polyacrylamide gel）

系由丙稀酰胺（acrylamide）单体同交联化合物N，N^，-亚甲基双丙稀酰胺（N，N-methlenebisacrylamide）在聚合剂存在的条件下，交联而成的一种具三维网状结构的凝胶。

这种凝胶主要用于蛋白质凝胶电泳和DNA序列测定中序列胶的制备。它分辨DNA分子量大小的能力在1～1000bp之间（见表1）。

（1）聚丙稀酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis）

系一种应用聚丙稀酰胺为支持介质的高分辨率的区带电泳技术，简称PAGE，主要用于蛋白质和小分子量的DNA片段的电泳分离。

在此种凝胶电泳中，聚丙稀酰胺凝胶起到分子筛的作用，它的孔隙大小直接决定着分辨能力的大小。凝胶浓度越高其孔隙也就随之变得越小，分辨能力也就越强；反之凝胶的浓度越低其孔隙也就变得越大，分辨能力也就随之减弱。

例如2%的聚丙稀酰胺凝胶电泳的分辨力，可高达1-6bpDNA片段；而3%的聚丙稀酰胺凝胶电泳的分辨力，则下降到1000bp左右的DNA大片段。

表1   凝胶电泳分辨DNA分子片段的能力

凝胶的类型和浓度           分离的DNA片段大小（bp）

0.3%琼脂糖凝胶                50,000-1,000

0.7%琼脂糖凝胶                20,000-1,000

1.4%琼脂糖凝胶                 6,000-200

-------------------------------------------------------

4%聚丙稀酰胺                   1,000-100

10%聚丙稀酰胺                    500-25

20%聚丙稀酰胺                     50-1

（2）聚丙稀酰胺凝胶的优点：

   **，由于聚丙稀酰胺凝胶是一种具三维网状结构的聚合物，因此这就决定了它同其他电泳支持物的区别。即它具有分子筛的作用，因此物质在通过凝胶网状结构之空隙时，要受到摩擦力（即阻力）的影响。所以大分子在泳动过程中受到的阻力要比小分子的大。正是由于凝胶具有“分子筛”和“电泳”双重作用，从而大大提高了分辨力，能够将蛋白质或DNA片段混合物按分子大小精细地分离开来。

具有分子筛和电泳双功能作用。

第二，凝胶的格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基。因此，凝胶的电渗作用比较小，不容易和电泳样品发生相互作用，而淀粉凝胶有时还带有一些阴离子基，电泳时会发生反向的电渗流动。

稳定性好，不易与电泳样品发生相互作用。

第三，由于聚丙稀酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前调节单体的浓度比例，就可形成不同程度的交联结构，其空隙大小可以在较大范围内发生变化。据此我们可以按照要分离的物质之分子量大小，选择适当的凝胶浓度，使之既具有适当的空隙，又具有较好的机械性能。

    分辨能力可根据实验要求进行调节。

第四，在一定的浓度范围内，聚丙稀酰胺具有热稳定性，而且无色透明便于实验观察，可以使用有关仪器直接检测实验结果等。

物理性能好，便于实验操作与观察。

2. 琼脂糖凝胶（agarose gel）

系一种从红色海藻的琼脂中提取的线性多糖聚合物，可以用来配制核酸（DNA或RNA）电泳凝胶。当琼脂糖加热到沸点后冷却凝固便会形成一种基质，其密度是由琼脂糖浓度决定的。琼脂糖的浓度越高，凝胶的孔隙就越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度降低，孔隙增大，分辨能力也就随之减弱。

可以被琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段的大小范围为0.2～50kb之间。经过化学修饰的低熔点的琼脂糖凝胶（law melting-point agarose gel,LMP）在结构上比较脆弱，因此在较低的温度下便会被熔化，故可以用于按熔化法制备DNA片段（电泳法制备）。

琼脂糖分辨DNA片段的能力在0.2～50kb之间。

三   琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）

1. 定义：

以琼脂糖为支持介质的一种重要的凝胶电泳技术。它在DNA及基因工程研究工作中有广泛的用途。

实验室中常用的琼脂糖有常熔点的和低熔点（LMP）的两种。后者的商品价格要比前者的贵得多。

2. 分辨能力与敏感性

琼脂糖凝胶电泳分辨DNA片段的能力与所用的琼脂糖凝胶的浓度密切相关：琼脂糖的浓度越高，分辨DNA片段的能力也就越高，反之也越低。

例如：2 %的琼脂糖凝胶电泳，可分辨小到300bp的DNA分子；而0.3%的琼脂糖凝胶电泳，则只能分辨分子量高达1,000～50,000bp（1～50kb）的DNA分子。

3. LMP琼脂糖凝胶电泳的优点：

（1）具有较低的熔点，即62～65⁰C。

（2）能较长时间保持液体状态。琼脂糖一旦熔解，便可在37⁰C下持续保持液体状态达数小时之久；在25⁰C下，也可以持续保持液体状态约10分钟。

（3）可直接回收DNA分子。 LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶的方式，将凝胶在65⁰C下加热熔化，然后直接向液态的凝胶中加入过量的酚液抽提DNA，经离心得到的上清液中，便含有除去了凝胶的DNA分子。

（4）可直接进行一定的酶催反应。一旦LMP凝胶已经溶化，并在37⁰C下保持液体状态，便可直接进行一定的酶切反应。

（5）敏感性高。在加入EtBr（溴化乙锭）的情况下，凝胶电泳分离所得的DNA条带，只需含有0.05μg的DNA，便可在UV下显现出清晰的条带。

（6）分辨DNA片段大小的范围较大。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb之间；要分辨较小的分子量之DNA片段则要用聚丙稀酰胺凝胶，其分辨DNA片段的大小范围介于1-1000个bp之间。

注意：常熔点的琼脂糖凝胶还可作为Southern及Northern杂交实验的支持介质。

4. 指示剂

在琼脂糖凝胶-DNA电泳中，常用溴酚兰（bromophenol blue ,Bb）和二甲苯青（xylene cyanol,Xc）作为指示剂，以检测DNA样品的泳动进程。

（1）溴酚兰

     溴酚兰呈蓝紫色，分子量为670 Da，在不同浓度的凝胶中，其迁移速度没有明显的变化。在琼脂糖浓度分别为o.6%、1%、2%的电泳中，溴酚兰分子的电泳迁移率大体上 与    分子长度为1000bp、600bp以及150bp的双链线性DNA片段的相当。

在含有7～8mol/L尿素的5%之聚丙烯酰胺凝胶电泳中，溴酚兰的电泳迁移率，大体

上分别与65mer和35mer的寡核苷酸迁移率相当。

（2）二甲苯青

二甲苯青呈蓝色，分子量为554.6Da，由于它所携带的电荷比溴酚兰的少，故在凝胶中的迁移率比溴酚兰的慢。在琼脂糖浓度为1%和1.4%的凝胶电泳中，二甲苯青分子的电泳迁移率，大体上与分子长度为2000bp和1600bp的双链线性的DNA片段的相当。

在含有7～8mol/L尿素的5%之聚丙烯酰胺凝胶电泳中，二甲苯青的电泳迁移率，大体上分别相当于260mer和130mer核苷酸的电泳迁移率。在凝胶电泳中加入指示剂，为何时停止电泳提供了有用的参照指标。

5. 染色剂

在凝胶电泳胶板中，DNA的条带位置需要经过适当的染色才能显现出来。常用的核酸染色剂有溴化乙锭（ethidium bromide,EtBr或EB）、吖啶橙（acridine orange,AO）、银（Ag^＋）试剂和亚甲蓝（methylene blue）等4种，其中*常用的是EtBr。

（1）溴化乙锭染色原理

   溴化乙锭是一种具扁平分子结构特征的核酸（DNA或RNA）荧光染料，可以在300nm波长的紫外光照射下发射出荧光，它可以插入到DNA(或RNA分子)的相邻碱基之间，从而使其密度下降，影响到DNA分子的浮力密度。

由于溴化乙锭染料只能同核酸分子结合，而不能同凝胶结合，所以在紫外光照射下，便可将存在于琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳凝胶中的核酸分子，以荧光谱带形式显现出来。

（2）溴化乙锭检测核酸的敏感性

   在凝胶电泳中，EB-DNA电泳谱带的荧光强度，比凝胶中游离的EtBr分子发出的荧光强度至少要强10倍，而且在一定程度上是与DNA片段的分子大小或数量成正比的。因此，电泳的DNA可在凝胶中呈现出清晰的荧光谱带，即便每条DNA电泳条带中仅含有50ng微量的DNA，也可以被清晰地显现出来。

若电泳凝胶中核酸样品的含量太少，而凝胶中EtBr染色的背景又太深，可将凝胶浸泡在浓度为1mmol/L的MgS0₄溶液中一小时，或是浸泡在浓度为10mmol/L的MgCl₂溶液中5分钟，使凝胶中游离的EtBr褪色，从而减少未结合的EtBr产生的背景荧光。经如此处理之后，便可检测到仅含有10ng的DNA电泳带。

（3）溴化乙锭的局限性：

a. EtBr是一种强致癌物质

           所以操作要特别小心谨慎，需要带双重手套，不要污染实验室及周围环境。

所用的试管及器皿，凡被EtBr污染都要丢弃在专用的实验污物桶中

b. EtBr见光容易分解

EtBr溶液（10mg/ml）应该在棕色瓶中配制，并放置在4⁰C冰箱中贮藏。

电泳操作应在暗室中进行，染色也应避光，并尽快拍照以免EtBr见光分解。

c. EtBr对不同波长的UV敏感性不同

254nm的紫外线由核酸吸收后传递给EtBr，所以该波长的UV对核酸的损害作用   较大，会造成核酸链的断裂或形成嘧啶二聚体。而300nm和360nm波长的紫外线主要由EtBr分子直接吸收，故此波长的UV对核酸的损害作用不大。所以说，电泳后DNA片段的回收应在360nm的紫外光下操作，这样的DNA所受的损伤就比较小。而拍摄EtBr-DNA凝胶电泳荧光谱带，则要在300nmUV下进行，因其敏感性*高。

6. 1%琼脂糖凝胶的配制

在250ml或300mL的三角瓶中加入100ml电泳缓冲液TAE或

TAB和1克的琼脂糖，置顶载天平上称重，并记录。

↓

充分混匀后置微波炉中加热约2～3min，使胶完全溶化

（一沸腾即关掉微波炉，并取出三角瓶仔细观察，如

未完全熔化，再作短时间加热）。

↓

完全熔化后再用顶载天平称重，并加电泳缓冲液恢复

至原来重量。用自来水或水溶致冷至55⁰C左右，冷却

期间要不断转动三角瓶使均匀降温。

↓

加入10mg/ml溴化乙锭溶液5μl，使终浓度为0.5μg/ml。缓

和地旋转三角瓶使之混合均匀。然后慢慢地注入两端已用胶带

封闭的电泳凝胶托盘中。并加上梳子。室温下静置冷却至少30

分钟。也可以放置在4⁰C冰箱中冷却。冷却的时间长短取决于

凝胶是否完全凝固。注检查凝胶中不得有任何残留的气泡，形           

成的固体凝胶表面应光滑平整。

↓

撕掉电泳凝胶托盘两端的胶带后，移放在电泳槽中，注入电泳

缓冲液，仔细拔掉梳子，并及时用100μl加样器冲去残留

在上样槽中液态琼脂糖。注意，要求电泳缓冲液应高于胶面约

2mm左右！

↓

取约1μg的DNA制剂加在20μL 1×的电泳加样指示剂中，混匀后用P20加样器（pipeteman）给每个样品槽中各加入样品20μL。

↓

在室温的条件下，设定电压为80V/20V,电泳费时约2：30小时。

↓

拍照记录电泳结果，并把所得照片作为记录保存备查！

7. 琼脂糖凝胶电泳若干注意事项

   a．本实验涉及的EtBr和UV都是对人体有害的物质，所以操作者需要特别小心在意，以免损害身心健康。

   b．要注意带手套（双层）和保护眼睛，**是专用的有机玻璃制作的。

   c．0.7%的琼脂糖凝胶，在20kb-300bp范围内，可形成清晰的电泳条带；1.0%的胶浓度，分离DNA片段范围为12kb-500bp之间；若要分离更短的片段可使用1.4%的胶浓度，其分辨率在6kb-200bp之间。

   d．在70V下电泳7.8小时，溴酚蓝移动的距离为15cm，大体上相当于300bp DNA片段的移动距离。

8.溶液的配制

（1）电泳缓冲液配制

50XTAE：

Tris-HCl（pH 8.0）               242g

冰乙酸                           57.1ml

0.5M EDTA（pH 8.0）             100ml

G.DH₂0                      →   1000ml

5xTBE：

                       Tris-HCl（pH 8.0）              54g

                      硼酸（boric acid）               27.5g

                      0.5M EDTA （pH8.0）              20ml

                      G.D.H₂0                  →     1000ml

注：Tris-borate缓冲液是一种高容量的缓冲电解质（high-capacity buffer electrolyte ），可获得清晰锐利的电泳条带。配成10×的TBE母液不容易生长微生物，所以可长时间贮藏而不长菌污染！但长时间贮藏会形成一种碱可溶性（alkaline-soluble）的沉淀物。在存在硼酸盐的情况下，琼脂糖凝胶不会被高浓度的NaClO₄或KCl溶解。

（2）琼脂糖凝胶电泳加样指示剂

5X loading dye［0.25%溴酚兰，0.25%二苯甲青，50%甘油(溶于水中）］

                          甘油 （glycerol）          50ml

                          溴酚兰（bromphenol blue）   0.5g

                          二甲苯青（xylene cyanol）   0.5g

                          5× 电泳缓冲液        →   100ml

注：溴酚蓝和二甲苯青在碱性的条件下会被分解。后者的电泳迁移率比前者低。

（3）溴化乙锭溶液（10mg/ml）

                         溴化乙锭(Ethidium bromide)        1.0g

                         G.D.H₂0                   →      100ml

        置棕色瓶中，搅拌数小时至完全溶解，再用锡箔纸包裹瓶子贮藏4⁰C冰箱备用。

-------------------------------------------------------------------------------

DNA分子量标记

λDNA经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切可产生出如下不同长度的片段：

5148bp;4848bp;4268bp;3530bp;2027bp;1904bp;1500bp;1375bp;956bp;947bp;564bp125bp。

λDNA经HindⅢ双酶切可产生出如下不同长度的片段：

(Reaction mixture：0.5μg in 12μl，Givse marvers)

23130bp;9419bp;6557bp;4371bp;2322bp;2028bp;564bp;125bp。

pBR322经EcoRⅠ和HinfⅠ双酶切可产生如下不同长度的片段：

（reaction mixture：o.8μg in 15μl）

1000bp;631bp517bp;506bp;396bp;344bp;298bp;221bp;220bp;154bp;75bp。

pBR322经BgⅠ和PvuⅡ双酶切可产生如下不同长度的片段：

1804bp;1420bp;899bp;234bp。

pBR32经HinfⅠ酶切可产生出如下不同长度的片段：

（reaction mixture：o.8μg in 15μl）

1631bp;517bp;506bp;396bp;344bp;298bp;221bp;220bp;154bp;75bp。

2117bp;1565bp;680bp。

pBR32经EcoRⅠ酶切可产生出如下不同长度的片段：（pBR32WV＝4.4kb）

（reaction mixture：o.1μg pBR322 DNA in 3μl For the standard for estimating the amount of DNA in an unknown：put 3μl in one welland 9μl in anotherb wellfor 0.1 and0.3μg）