聚合酶链式反应（PCR）

聚合酶链式反应（PCR）

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外扩增特异性DNA片段的技术。经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍。

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶*适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

一、PCR基本原理：

   DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

PCR扩增靶DNA的过程类似于体内DNA的半保留复制，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。利用人工合成的一对寡核苷酸引物，分别与待扩增DNA片段的两侧翼序列互补，在DNA聚合酶催化下，以靶DNA序列为模板，四种dNTP为原料，经过高温变性、低温退火和中温延伸“三步曲”的循环，使靶DNA片段经过30个循环周期后达到百万倍的扩增。

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

以一个双链DNA模板分子为例，第n次循环时，获得的靶DNA短片段数量为2的n次方-2n条。

二、PCR反应体系

PCR五要素：

  1、模板DNA（Chelex-100提取法，用5%Chelex-100溶液悬浮检材细胞，根据需要加入蛋白酶K，经56孵化和100加温，在低渗条件下破坏细胞膜和核膜，释放DNA，离心后的上清液即可作为PCR反应的模板DNA液）；

  2、寡核苷酸引物；

  3、dNTP；

  4、反应缓冲液；

  5、Taq-DNA聚合酶

实验试剂与器材:模板DNA、dNTP、Taq DNA聚合酶、蒸馏水、PCR缓冲液、引物、氯化镁、PCR仪、移液枪、PCR板、薄壁管、离心管、离心管盒

标准的PCR反应体系 ：模板DNA    2μL

                     引物1      1μL

                     引物2      1μL

                     dNTP      1.5μL

                     MgCl2        2μL

                     10×buffer    2μL

                     ddH2O      10μL

                     Taq酶      0.5μL

PCR反应条件的控制

1.   PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。

2.   镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。

3.   底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。

4.   TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。

5.   引物 浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。

6.   反应温度

（1）变性温度和时间95℃，30 s。

（2）退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。

（3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。

（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)

7.   循环次数 ：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

标准的PCR过程分为三步：

    变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

    退火（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

    延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性**）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

检测：荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是*常用的检测手段

3、PCR技术特点

   1、灵敏度高

   2、特异性高     

     PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。

   3、适用于降解DNA检材

   4、种属特异性好

   5、PCR操作简单，时间短，耐热性DNA聚合酶的应用，使PCR的温度循环实现了自动化。

四、注意事项：

1、由于PCR反应灵敏度很高，因此要特别主意防止DNA污染的发生。样品间的相互污染可能产生假阳性结果，特别是将PCR技术应用到临床病原菌感染确定中。

2、如果是公用的、没有密码保护的PCR仪，经常检查PCR仪上的程序正确与否。

3、不使用过量试剂“less is usually better (more specific)”。

4、试剂购回后应分装成小份使用，这样一旦有污染发生，可以立即丢弃污染的试剂，不会造成大的损失；试剂分装也有助于减少反复冻融次数（例如dNTPs对反复冻融敏感）。

5、加完所有试剂后用枪头吹打几次或稍微涡旋或轻弹管壁以保证充分混匀。

6、使用阴性对照检查污染的发生。

7、使用阳性对照（能良好扩增的样本）。

8、电泳时使用DNA分子量标准品（指示是否PCR失败或条带跑出凝胶或拍照系统失败）。

9、当扩增很长的、GC含量高的模板时或容易产生二级结构的模板时适量使用添加剂（glycerol, formamide, NMP使变性和退火温度降低几度；glycerol也可起到稳定聚合酶活性的作用；DMSO 减少二级结构的发生，并通过减弱非特异性引物结合的稳定性，提高反应的特异性）。

10、不使用带有自动除霜功能的冰箱存储酶（避免反复冻融），每次取酶时都使用新的枪头酶，酶使用后应立即放回冰箱。酶要在加完缓冲液后再加，直接将酶加入水中可能导致酶变性失活。

11、PCR产物的电泳检测时间，一般为48 h以内，有些**于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

五、其他

一、   PCR反应的关键环节

1.   模板核酸的制备。

2.   引物的质量与特异性。

3.   酶的质量。

4.   PCR循环条件。

二、 PCR常见问题及对策

1.   假阴性，不出现扩增条带

（1）模板原因

①   模板中含有杂蛋白质。

②   模板中含有Taq酶抑制剂。

③   模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白。

④   在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤   模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

（2）酶失活

①   需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。

②   忘加Taq酶或溴乙锭。

（3）引物

①   引物质量。

②   引物的浓度。

③   两条引物的浓度是否对称。

解决对策：

①   选定一个好的引物合成单 位。

②   引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③   引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④   引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

（4）Mg2+浓度

①   浓度过高降低PCR扩增的特异性。

②   浓度过低影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

（5）反应体积的改变

①   通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定;

②   在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

（6）物理原因

①   变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性。

②   退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

③   扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度有问题。

（7）靶序列变异

①   靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合。

②   靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列。

2.   假阳性，出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

（1）引物设计不合适

①   选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性。

②   靶序列太短或引物太短。

（2）靶序列或扩增产物的交叉污染

①   整个基因组或大片段的交叉污染。

解决方案：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

②   空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。

解决方案：可用巢式PCR方法来减轻或消除。

3.   出现非特异性扩增：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

（1）   引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体。

（2） Mg2+离子浓度过高。

（3） 退火温度过低。

（4） PCR循环次数 过多有关。

（5） 酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

4.   出现片状拖带或涂抹带

（1）原因

①   酶量过多。

②   酶的质量差。

③   dNTP浓度过高。

④   Mg2+浓度过高。

⑤   退火温度过低。

⑥   循环次数过多引起。

（2）对策

① 减少酶量。

②   调换另一来源的酶。

③   减少dNTP的浓度。

④   适当降低Mg2+浓度。

⑤   增加模板量。

⑥   减少循环次数。