RFLP和RAPD技術

RFLP和RAPD技術

一、RFLP技術

DNA的多態性檢測技術是進行基因組研究的基礎。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段長度多態性)已被廣泛用於基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。RFLP是根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位元點堿基發生突變，或酶切位元點之間發生了堿基的插入、缺失，導致酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態性），多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關係。所用的探針爲來源於同種或不同種基因組DNA的選殖，位於染色體的不同位點，從而可以作爲一種分子標記(Mark)，構建分子圖譜。當某個性狀（基因）與某個（些）分子標記協同分離時，表明這個性狀（基因）與分子標記連鎖。分子標記與性狀之間交換值的大小，即表示目標基因與分子標記之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標記選殖在質粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內切酶切割基因組DNA後，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內切酶與分子標記組成不同組合進行研究。常用的限制性內切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標記則有幾個甚至上千個。分子標記越多，則所構建的圖譜就越飽和。構建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標之一。

　　運用隨機引子對擴增尋找多態性DNA片段可作爲分子標記。這種方法即爲RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，隨機擴增的多態性DNA)。儘管RAPD技術誕生的時間很短, 但由於其獨特的檢測DNA多態性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術已滲透于基因組研究的各個方面。該RAPD技術建立於PCR技術基礎上,它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常爲10聚體)爲引子,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經EB染色或放射性自顯影來檢測擴增産物DNA片段的多態性,這些擴增産物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD所用的一系列引子DNA序列各不相同,但對於任一特異的引子,它同基因組DNA序列有其特異的結合位點.這些特異的結合位元點在基因組某些區域內的分佈如符合PCR擴增反應的條件,即引子在模板的兩條鏈上有互補位置,且引子3'端相距在一定的長度範圍之內,就可擴增出DNA片段.因此如果基因組在這些區域發生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能導致這些特定結合位元點分佈發生相應的變化,而使PCR産物增加、缺少或發生分子量的改變。通過對PCR産物檢測即可檢出基因組DNA的多態性。分析時可用的引子數很大,雖然對每一個引子而言其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的,但是利用一系列引子則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。另外，RAPD片段選殖後可作爲RFLP的分子標記進行作圖分析。

　　本實驗將學習RFLP的內切酶切剪、電泳以及RAPD技術。   

RFLP技術

一、 材料

基因組DNA(大於50kb,分別來自不同的材料)。

二、設備

電泳儀及電泳槽， 照相用塑膠盆5只，玻璃或塑膠板(比膠塊略大) 4塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙 ，eppendorf管(0.5ml)若干。

三、試劑：

1、限制性內切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩衝液。

2、10×TBE電泳緩衝液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％ Triton X-100。

3、MgCl2 ：25mmol/L。

4、4種dNTP混合物:每種2.5mmol/L。

5、Taq DNA聚合酶5U/μl。

6、其他試劑：ddH2O，Agarose 0.8%。

四. 操作步驟

1. 基因組DNA PCR反應

2. 在50μl反應體系中,進行酶切反應:

　　　　5μg基因組DNA

　　　　5μl 10×酶切緩衝液

　　　　20單位（U）限制酶(任意一種)

　　　　加ddH2 O, 至50μl

3. 輕微振蕩, 離心,37℃反應過夜。

4. 取5μl反應液,0.8％瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時不應有大於30kb的明顯亮帶出現。

　　[注意] 未酶切的DNA要防止發生降解, 酶切反應一定要徹底。

二、RAPD技術

一、 材料

不同來源的DNA(50ng/ul)。

二、設備

PCR核酸擴增儀，PCR管，電泳裝置。

三、試劑

1、隨機引子(10mer) (5umol/L)：購買成品。

2、Taq酶：購買成品。

3、10xPCR 緩衝液。

4、MgCl2 ：25mmol/L。

5、dNTP：每種2.5mmol/L。

四、操作步驟：

　　1. 在25ul反應體系中,加入

　　　　模板DNA 1ul (50ng)

　　　　隨機引子 1ul (約5pmol)

　　　　10xPCR Buffer 2.5ul

　　　　MgCl2 2ul

　　　　dNTP 2ul

　　　　Taq酶 1單位（U）

　　　　加ddH2O 至 25ul 　　混勻稍離心

2. 在加熱至90℃以上的PCR儀中預變性94℃ 2分鐘, 然後迴圈: 94℃ 1分鐘， 36℃ 1分鐘， 72℃ 1分鐘，共35 cycles。

3. 反應結束後, 72℃ 10分鐘，4℃保存。

4. 取PCR産物15ul加3ul上樣緩衝液(6x)於2% 瓊脂糖膠上電泳, 穩壓50-100Ｖ（電壓低帶型整齊，解析度高）。

5. 電泳結束，觀察、拍照。

　　[注意] 1、電泳時一般RAPD帶有5-15條, 大小0.1-2.0kb。

　　　　2、 特異性的DNA帶可以選殖作爲一個新的分子標記應用。

問題

　　1. DNA限制酶切剪反應不徹底會有何結果? DNA發生降解有何影響？

　　2. 隨機引子擴增,爲什麽會産生DNA雙鏈産物?