大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）

大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）

细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。

1实验方法原理：

带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。

2实验材料、试剂、仪器耗材：

E. coli DH5α菌株

LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等

培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等

3实验步骤：

1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。

2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。

3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。

4、倒出培养液，将管倒置1 min以使*后的痕量培养液流尽。

5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。

6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。

7、倒出培养液，将管倒置1 min以使*后的痕量培养液流尽。

8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。

9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。

4注意事项：

1. 为达到高效转化，活细胞数务必少于10 8个细胞/mL，对于大多散大脑杆菌来说，这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20 min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD值列一个图表，以便预测培养物的OD600值到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。

2. 在菌株与菌株之间，OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大，因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并将各稀释维度的培养物铺于无抗生素的LB琼脂板以计算每一时相的活细胞散，从而使分光光度计读数得到标准化。

3. 对大多数大肠杆菌（MC106除外），采用TFB代替CaCl2可得到相同或更好的结果。Dagert和Ehrlieh的实验(1979)曾表明，细胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48 h，在贮存的*初12-24 h内，转化率增加4-6倍，然后降低到初始水平。

4. 克隆的新鲜程度，一定要选新鲜平板的单克隆，即刚涂布生长过夜的平板。

5. 菌体的OD600值，JM109或BL21，OD值为0.35，DH5α 为0.4，要尽量保证OD值不要过高，更不能超过0.6。

6. 低温处理的时间，做完后冰上保存12-24 h后分装，并保存于-80℃。

7. 试剂和用品，所有的用品（离心管、药瓶等）用新的，如果使用旧的，要确保干净，CaCl2溶液。

转化（热击法）

大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。

1原理：

质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

2器材：

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。

3材料和试剂：

质粒DNA，重组DNA，培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。

4实验准备：

无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。

5操作步骤：

（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。

（2）从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。

（3） 加入5μl连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。

（4） 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。

（5） 在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h.

（6） 在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。

（7） 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

（8） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

（9） 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

（10）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。