细胞融合

细胞融合

基本介绍

    有性繁殖时发生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成一个新的的二倍体。在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。　基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。

细胞融合原理 ：

    两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，也称细胞杂交，在自然情况下的受精过程即属这种现象。

    诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。

1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，*常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，*后形成融合细胞。

2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中*常用的是聚已二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。

3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。

    细胞融合技术在基因定位、基因表达产物、肿瘤诊断核治疗、生物新品种培育及单克隆抗体技术等领域有着非常广泛的应用前景。单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。

发展简史

    20世纪30年代，科学家们相继在肺结核，天花，水痘，麻疹等疾病患者的病理组织中观察到多核细胞。　　

    20世纪70年代，科学家们在蛙的血细胞中也看到了多核细胞的现象，但是当时科学发展水平的限制，没有给予足够重视。　　

    1962年，日本科学家发现日本血凝型病毒能引起艾氏腹水瘤细胞融合的现象。　　

    1965年，英国科学家进一步证实了灭活的病毒在适当的条件下也可以诱发动物细胞融合。　　

    后来科学家又成功诱导了不同种动物的体细胞融合，并且能将杂种细胞培养成活。细胞融合技术不断改进，现在已广泛应用于细胞学，遗传学，免疫学，病毒学等多种学科的研究工作中。　　

过程　　

    细胞膜有内外两层，细胞融合首先发生在外层，然后再到内层，由此就出现了两种融合通道，细胞体内物质通过这两种通道转移。病毒膜与目标细胞融合时，只出现一种融合通道，即导致融合的基因只能在病毒中找到，而在目标细胞中却找不到。但是，通过EFF-1发生的细胞融合则是一个双向融合过程，需要EFF-1出现在两个相互融合的细胞中。

细胞融合的意义：

1.理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。　　

2.融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。　　

3.体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。　　

4.淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。

融合方法

    同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。 仙台病毒法融合

①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞　　膜上。并使两细胞相互凝聚；　　

②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，*适PH为8.0一8.2；　　

③细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；　　

④融合成巨大细胞，仍需ATP 。

聚乙二醇（PEG）法

　　聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于　　200小于6000者均可用作细胞融合剂。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合剂**，50%PEG溶液能产生*多杂交细胞。PEG溶液在pH6.0时细胞融合率*高。

电融合法

    在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。　　

优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。

融合诱导物

    细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有生物法用灭活的仙台病毒(Sendai virus)，化学法如用聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和物理法如电脉冲。目前应用*广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。动植物细胞融合方法不同，生物法利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。　　

    自发条件下或人工诱导下, 两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合导致异核体(heterokaryon)的形成, 异核体通过细胞有丝分裂导致核的融合, 形成单核的杂种细胞。有性生殖时发生正常的细胞融合, 即由两个配子融合成一个合子。

实验操作

　　（以人鼠细胞杂交为例）人、鼠细胞融合实验分三步进行∶首先用荧光染料标记抗体∶将小鼠的抗体与发绿色荧光的荧光素(fluorescin)结合, 人的抗体与发红色荧光的罗丹明(rhodamine)结合；第二步是将小鼠细胞和人细胞在灭活的仙台病毒的诱导下进行融合；*后一步将标记的抗体加入到融合的人、鼠细胞中，让这些标记抗体同融合细胞膜上相应的抗原结合。开始,融合的细胞一半是红色, 一半是绿色。在37℃下40分钟后, 两种颜色的荧光在融合的杂种细胞表面呈均匀分布，这说明抗原蛋白在膜平面内经扩散运动而重新分布。这种过程不需要ATP。如果将对照实验的融合细胞置于低温(1℃)下培育, 则抗原蛋白基本停止运动。这一实验结果令人信服地证明了膜整合蛋白的侧向扩散运动。

应用价值

　　细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体，单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。

单克隆抗体的基本概念

    抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

单克隆抗体技术的基本原理

    要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。